研究巨噬功能能時，我們經常用荷蘭liposoma的巨細胞清除劑Clodronate Liposomes氨騰酸二鈉脂質體(貨號CP-005-005)清除體內巨噬細胞、然后回輸修飾或者感興趣的目的巨噬細胞。既要確保原位的巨噬細胞被很好的清除，又要讓回輸的巨細胞在早起階段及時發揮作用且不能被巨細胞清除劑清除了。這種既要，又要，就要求注射清除劑后，合適的時間點回輸目的細胞。鑒于回輸實驗比較難做，回輸細胞的數量，活率，純度以及功能性活性都決定了Transfer實驗的成功與否。

回輸的細胞類型：

WT和CD1d-KO小鼠。GM-CSF cultured bone-marrow derived cells (BMDCs) 骨髓來源GM-CSF培養刺激后的細胞

回輸細胞的準備：

Generation of BMDCs and isolation of pMacs

Bone marrow cells were flushed from the femurs and tibias with cold PBS, filtered through a 45?μm strainer, pelleted by centrifugation and resuspended in complete RPMI media (Gibco; 10% FCS, 100 U/ml penicillin, 100?μg/ml streptomycin, 14.3?μM β-Mercaptoethanol) supplemented with 20?ng/ml of GM-CSF (Biolegend). Medium was changed at days 3 and 4 of culture and cells were harvested on day 6. For stimulation experiments, CD11c+ cells were enriched by positive selection with CD11c magnetic beads (CD11c MicroBeads UltraPure, Miltenyi).

To isolate pMacs, mice were sacrificed using CO2 and 4?ml of ice-cold PBS injected into the peritoneal cavity. The peritoneal cavity was briefly massaged and cells recovered using a 10?ml syringe. For stimulation experiments pMacs were enriched by positive selection with F4/80 magnetic beads (Anti-F4/80 MicroBeads UltraPure, Miltenyi).

Clodronate Liposomes清除巨噬細胞后回輸細胞解決方案：

清除劑注射方式：腹腔注射（不一定優選）

清除劑注射劑量：200ul

回輸細胞的數量：3x10^6

回輸細胞的時間點：清除劑給藥后72h

實驗數據一：

WT小鼠腹腔注射荷蘭Liposoma巨噬細胞清除劑，72h后，Transfer回輸WT，CD1d-KO小鼠的骨髓來源細胞。造模LPS誘導的炎性模型。根據實驗數據，支持在LPS造模后，用CD1d-KO細胞重建的小鼠表現出對LPS誘導的炎癥更高的易感性，與用WT細胞重建的小鼠相比，體溫降低以及血液中細胞因子的濃度提高。數據支持CD1d在髓系細胞中對TLR反應的負向調節作用。

實驗數據二：

WT小鼠腹腔注射荷蘭Liposoma巨噬細胞清除劑，72h后，Transfer回輸WT，CD1d-KO小鼠的骨髓來源細胞。調查CD36是否會導致CD1d-KO細胞中脂質攝取的增加。引入實驗變量CD36，sulfosuccinimidyl oleate (SSO)：是一種長鏈脂肪酸,抑制脂肪酸向細胞轉運。可以封閉阻斷CD36。

CD36 是一種多功能糖蛋白，可作為多種配體的受體，包括血小板反應蛋白、纖連蛋白、膠原蛋白或β淀粉樣蛋白等蛋白質實體，以及氧化低密度脂蛋白 (oxLDL)、陰離子磷脂等脂質成分。長鏈脂肪酸和細菌二酰化脂肽。這些配體具有多價性，可以同時與多個受體結合，促進 CD36 簇的形成，從而啟動信號轉導和受體-配體復合物的內化。對輔助受體信號傳導的依賴性明顯是配體特異性的。細胞對這些配體的反應在腸道內的血管生成、炎癥反應、脂肪酸代謝、味覺和膳食脂肪加工中發揮著關鍵作用。此外，CD36 結合長鏈脂肪酸，促進其轉運到細胞中并參與肌肉脂質利用、脂肪能量儲存和腸道脂肪吸收。從機制上講，脂肪酸結合會激活下游激酶 LYN，磷酸化棕櫚酰轉移酶 ZDHHC5，并導致 CD36 去棕櫚酰化和小凹胞吞作用。在小腸中，CD36 可能通過激活 MAPK1/3 (ERK1/2) 信號通路在膳食脂肪酸和膽固醇的近端吸收中發揮作用。它還涉及口腔脂肪的感知和偏好，介導味覺受體細胞中細胞內鈣水平的增加。此外，CD36 是長鏈脂肪酸腹內側下丘腦神經元感知以及能量和葡萄糖穩態調節的重要因素。作為血小板反應蛋白的受體，CD36 介導其抗血管生成作用，并與 THBS1 合作，響應游離脂肪酸升高而誘導足細胞凋亡。作為 TLR4:TLR6 異二聚體的輔助受體，CD36 在配體結合后促進單核細胞/巨噬細胞的炎癥，通過 NLRP3 炎癥小體的啟動和激活，導致 NF-κ-B 依賴性細胞因子的產生和 IL1B 的分泌。此外，CD36 作為微生物二酰化脂肽的選擇性和非冗余傳感器，觸發 NF-κ-B 依賴性 TNF 產生，并隨后通過 TLR2:TLR6 異二聚體信號傳導靶向脂筏依賴性途徑中的高爾基體。在微生物感染的情況下，CD36 直接介導惡性瘧原蟲寄生的紅細胞的細胞粘附和顆粒的內化，與 TLR 信號傳導無關。

中文摘要：

細胞代謝的變化支撐著巨噬細胞的激活，但目前對關鍵免疫分子如何調節巨噬細胞的代謝程序知之甚少。在這里，我們揭示了抗原呈遞分子CD1d在脂質代謝控制中的作用。我們展示了缺乏CD1d的巨噬細胞表現出代謝重編程，脂質代謝途徑下調，外源性脂質進口增加。這種代謝重組為巨噬細胞增強對先天信號的反應做好了準備，因為CD1d缺失的細胞在刺激類 Toll 樣受體后表現出更高的信號傳導和細胞因子分泌。在機制上，CD1d通過控制脂質轉運蛋白CD36的內吞作用來調節脂質進口，而阻斷通過CD36的脂質攝取可以恢復巨噬細胞的代謝和免疫反應。因此，我們的數據揭示了CD1d作為巨噬細胞中一個炎癥-代謝回路的關鍵調節因子，這一功能獨立于其對T細胞反應的調控。

英文摘要：

Alterations in cellular metabolism underpin macrophage activation, yet little is known regarding how key immunological molecules regulate metabolic programs in macrophages. Here we uncover a function for the antigen presenting molecule CD1d in the control of lipid metabolism. We show that CD1d-deficient macrophages exhibit a metabolic reprogramming, with a downregulation of lipid metabolic pathways and an increase in exogenous lipid import. This metabolic rewiring primes macrophages for enhanced responses to innate signals, as CD1d-KO cells show higher signalling and cytokine secretion upon Toll-like receptor stimulation. Mechanistically, CD1d modulates lipid import by controlling the internalization of the lipid transporter CD36, while blocking lipid uptake through CD36 restores metabolic and immune responses in macrophages. Thus, our data reveal CD1d as a key regulator of an inflammatory-metabolic circuit in macrophages, independent of its function in the control of T cell responses.

論文信息：

論文題目：CD1d-dependent rewiring of lipid metabolism in macrophages regulates innate immune responses

期刊名稱：Nature Communications

時間期卷：13, Article number: 6723 (2022)

在線時間：2022年11月7日

DOI：doi.org/10.1038/s41467-022-34532-x

產品信息：

貨號：CP-005-005

規格：5ml+5ml

品牌：Liposoma

產地：荷蘭

名稱：Clodronate Liposomes and Control Liposomes

辦事處：Target Technology（靶點科技）